STORM

(d)STORM:

(direct) Stochastic Optical Reconstruction Microscopy ((d)STORM) ist eine neue hochauflösende Technik, die Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze der klassischen Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. Dies geschieht durch eine präzise Lokalisierung einzelner Farbstoffmoleküle. Dazu sind spezielle Fluoreszenzfarbstoffe notwendig, die einen fluoreszenten und einen nichtfluoreszenten Zustand besitzen. Während des Messzeitraums werden kontinuierlich einige wenige photoaktive fluoreszierende Moleküle stochastisch aktiviert, wodurch eine präzise Positionsbestimmung möglich wird. Nach Ausbleichen beziehungsweise Schalten in den Dunkelzustand der Chromophore erfolgt ein erneuter Aktivierungs- und Detektionszyklus. Die anschließende Kombination der ermittelten Positionen erlaubt die Rekonstruktion der beobachteten Struktur mit hoher Auflösung. Da diese Messmethode deutlich längere Messzeiten als die klassische Fluoreszenzmikroskopie erfordert, ist es zumeist notwendig, die Proben zu fixieren.

Wir verfügen über drei Mikroskoptypen, an denen (d)STORM-Messungen vorgenommen werden können. Der erste Typ ist ein kommerzielles Nikon Eclipse Ti-E TIRF-Mikroskop und kombiniert die hohe laterale Auflösung von STORM mit der vertikalen Auflösung der TIRF-Mikroskopie.

Beim zweiten Mikroskoptyp handelt es sich um einen Eigenbau, basierend auf einem Nikon Eclipse Ti-E Mikroskop. Es benutzt eine sogenannte Astigmatismus-Detektion (B. Huang, W. Wang,  M. Bates, and X. Zhuang. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science 2008, 319(5864):810-813.). Die Bestimmung der z-Koordinate wird durch eine Zylinderlinse im Strahlengang erreicht und nutzt aus, dass die Zylinderlinse eine von der axialen Koordinate abhängige Elliptizität der Einzelmolekülbilder erzeugt. Dadurch kann auch die axiale Koordinate mit hoher Genauigkeit bestimmt werden, was die Aufnahme von 3D-Bildern  ermöglicht.

Der dritte Mikroskoptyp ist ein modularer Eigenbau mit gleichzeitiger Detektion durch zwei Objektive, wodurch sich besonders hohe Auflösungen erzielen lassen. Hier sind zwei verschiedene Optionen für 3D-Messungen implementiert, zum einen die Astigmatismus-Detektion (K. Xu, H. P. Babcock, and X. Zhuang. Dual-objective STORM reveals three-dimensional filament organization in the actin cytoskeleton. Nat. Methods 2012, 9(2):185–188) und zum anderen die interferometrische Detektion (G. Shtengel, J. A. Galbraith, C. G. Galbraith, J. Lippincott-Schwartz, J. M. Gillette, S. Manley, R. Sougrat, C. M. Waterman, P. Kanchanawong, M. W. Davidson, R. D. Fetter, and H. F. Hess. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2009, 106(9):3125–3130 sowie D. Aquino, A. Schönle, C. Geisler, C. v Middendorff, C. A. Wurm, Y. Okamura, T. Lang, S. W. Hell, and A. Egner. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4pi detection of stochastically switched fluorophores. Nature methods 2011, 8(4):353–359). Das zweite Verfahren erlaubt besonders präzise Messungen. Es eignet sich allerdings nur für dünne und homogene Proben.