Für den Monat Februar 2020 geht das "Paper of the Month" der Medizinischen Fakultät der WWU Münster an:

Dr. Dr. Boris V. Skryabin und Dr. Timofey S. Rozhdestvensky aus der  Core Facility TRAnsgenic animal and genetic engineering Models (TRAM)  für die Publikation:

Pervasive head-to-tail insertions of DNA templates mask desired CRISPR-Cas9-mediated genome editing events
BY: Skryabin, Boris V.; Kummerfeld, Delf-Magnus; Gubar, Leonid; et al.
SCIENCE ADVANCES Volume: 6 Issue: 7 eaax2941; Published: FEB 2020

Begründung der Auswahl:

Die Arbeit stellt eine gelungene interdisziplinäre Kooperation in der Medizinischen Fakultät dar. Sie ist von hohem methodischen Interesse, ein Zeugnis einer guten Fehlerkultur und zeigt den Nutzen einer kritischen, projektübergreifenden Evaluation von Ergebnissen.

Zu Hintergrund, Fragestellung und Bedeutung der Publikation:

Die Genom-Editierung mittels CRISPR-Cas9 hat sich bei einer Vielzahl von Organismen etabliert. Unter anderem wird die Technologie zur Generierung von Tiermodellen menschlicher Krankheiten eingesetzt. Darüber hinaus gibt es Versuche, das CRISPR-Cas9-System zur direkten Veränderung des menschlichen Genoms zu nutzen. Trotz vieler Vorteile gibt es jedoch noch einige Hürden, die den medizinischen Einsatz der CRISPR-Cas9-Technologie behindern.

Wir untersuchten Probleme im Zusammenhang mit dem zielgerichteten Einfügen einer DNA-Matrix (knock-in) ins Mausgenom. Beim Erzeugen von konditionalen Knock-out-Mausmodellen entdeckten wir, dass die homologen und/oder nicht-homologen Doppelstrangreparaturmechanismen mehrere unerwünschte Duplikationen der DNA-Matrix im Zielgenom verursachten. Die beobachteten systematischen Probleme waren abhängig von der Art der verwendeten DNA-Matrix. Wir konnten außerdem zeigen, dass die üblicherweise angewandte PCR-Analyse - in den meisten Fällen - solche Duplikationsereignisse nicht identifizieren konnte; daher sind weitere, tiefgreifende Analysen der modifizierten Allele unerlässlich. Dazu werden mehrere geeignete Methoden vorgeschlagen, um die korrekt modifizierten Chromosomen zu identifizieren.

Die Vervielfachung der DNA-Matrix ist ein häufiges Phänomen. Alle Knock-in-Verfahren wie die Einführung einer Punktmutation oder die Rekonstruktion fehlender/neuer Epitope, die die Genfunktion verbessern, leiden möglicherweise darunter. Unkontrollierte Vervielfachung der DNA-Matrix könnte schwerwiegende Folgen für die humane Gentherapie haben.

Background and fundamental question of the publication:

CRISPR-Cas9-mediated genome editing has emerged as a state of the art tool for precise gene modification in a wide range of organisms. This technology is broadly applied to the generation of animal models for the study of human diseases. Moreover, many groups attempt to use CRISPR-Cas9 to directly alter the human genome. However, despite its advantages, a few potential pitfalls impede its implementation in biomedicine and human gene therapy.

We documented problems associated with the direct insertion of donor DNA template (knock-in) during genome editing. While generating conditional knock-out mouse models, we discovered that homology-directed repair and/or non-homologous end-joining mechanisms frequently caused multiple unwanted head-to-tail insertions of donor DNA. Systematic obstacles were observed in association with different types of DNA templates utilized during genome editing. We demonstrated that conventionally applied PCR analysis—in most cases—failed to identify such multiple integration events; therefore, comprehensive analyses of modified alleles are essential. We suggested experimental approaches for the analyses of sequential mouse generations in order to identify precisely edited chromosomes reliably.

We showed that DNA template multiplication is a common phenomenon. Any knock-in procedure, e.g., introducing specific point mutations, or reconstructing missed/new epitopes to improve gene function could potentially suffer from this. Undetected donor DNA template multiplications could cause serious unwanted effects in human gene therapy approaches.

Die bisherigen ausgezeichneten "Papers of the Month" finden Sie HIER.