Eine grundsätzliche Problematik bei der Isolierung von EHEC aus Stuhlproben liegt darin, dass die den Darm besiedelnden apathogenen E. coli stets in größerer Zahl und mit breitem Typenspektrum gleichzeitig vorhanden sind. Beim HUS kommt es rasch zu einem Absinken der Erregerzahl von EHEC im Stuhl, wodurch die Stuhluntersuchung möglichst frühzeitig erfolgen sollte.

Gemeinsames Merkmal aller EHEC ist die Bildung der Shiga Toxine, deren Nachweis das wichtigste diagnostische Merkmal in der bakteriologischen Diagnostik ist. Hierfür stehen heute Enzym-Immuno-Assays zum Direktnachweis zur Verfügung. Häufig besitzen EHEC ein Virulenzplasmid, eine sog. Pathogenitätsinsel (LEE – locus of enterocyte effacement), sowie Gene, die für den Typ-III-Sekretionsapparat verantwortlich sind. Mittels molekularer Methoden können die entsprechenden Gene z. B. mittels PCR oder Kolonieblot-Hybridisierung nachgewiesen werden. Vorteil dieser Methoden ist, dass die Toxine oder ihre Gene auch in Keimgemischen aus dem Stuhl nachweisbar sind. Dieser Nachweis, der als hochgradiger Verdacht auf eine EHEC-Infektion gewertet wird, bedarf aber zur Bestätigung stets der anschließenden kulturellen Isolierung und Charakterisierung des Isolats mit erneutem Nachweis seiner Toxinbildung.
Darüber ist der Nachweis des Isolats essentiell für weitergehende Untersuchungen. Diese ermöglichen dann beispielsweise die Aufklärung von Infektketten, das Analysieren von Langzeittrends über die Entwicklung einzelner Serotypen und auch das Erkennen neuartiger Erreger, was Anpassungen in der Überwachung dieser Erreger nach sich ziehen kann.