Evolutive Anpassungen von Spermatogenese und testikulären Strukturen - spermatogoniale Stammzellsysteme, Reproduktionsendokrinologie und Spermienkompetition

Männliche Reproduktion unterliegt evolutiven Herausforderungen, die die Bildung „erfolgreicher“ Gameten beeinflusst. Unter diesen sind insbesondere zwei relevant, die Spermienkompetition und die spermatogonialen Stammzellsysteme. Während die Existenz von Spermienkompetition als gesichert gilt, ist noch nicht geklärt, ob und über welche Mechanismen sich diese Anforderung auf die Spermatogenese auswirkt. Grundsätzlich sind drei Möglichkeiten (oder eine Kombination daraus) denkbar: Für das Spermium hängt eine erfolgreiche Fertilisierung davon ab die Eizelle als erstes zu erreichen. Hierfür ist die Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien wesentlich, die von der Anzahl der Mitochondrien und der Leistungsfähigkeit der Flagelle und damit der Länge der Spermien abhängt. Weiterhin ist die reine Anzahl verfügbarer Spermien eine logische Determinante die mit der Menge seminiferen Epithels und/oder mit der Geschwindigkeit der Produktion korreliert. Wir befassen uns mit der Frage, wie sich Spermienkompetition im Hoden von Primaten und Vögeln abbildet und konnten bisher zeigen, dass in diesen Taxa unterschiedliche Adaptationen auf diese Herausforderung bestehen. Während sich bei Primaten kompetitive Verhältnisse tatsächlich nur in der relativen Hodengröße spiegeln, haben Vögel, das Verhältnis von seminiferem zu interstitiellem Gewebe angepasst und unterschiedliche Spermienlängen hervorgebracht. Erste Daten deuten zudem an, dass auch die Dauer zur Produktion reifer Gameten variabel ist. In der Keimbahn müssen auch Anpassungen an kurze oder lange reproduktive Lebensperioden entwickelt sein. Während sich beispielsweise eine Maus nur 1,5 Jahre lang vermehrt, sind Affen über viele Jahre fertil, was mit einem erhöhten Risiko für Verletzungen oder Infektionen einhergeht. Das heißt, dass die Aufgabe der Bereitstellung einer möglichst großen Anzahl fertiler Gameten gegen den Erhalt einer langlebigen Keimbahn zu balancieren ist. Eine der dafür relevanten Anpassungen sind unterschiedliche Stammzellsysteme. Die vergleichende Betrachtung der Organisation des Hodengewebes sowie der endokrinen Regulation der männlichen Reproduktion von Primaten ergab bis dahin unbekannte Befunde. So entspricht Hodengewebe von Neuweltaffen auf zellulärer Ebene und bezüglich der Entwicklungsabläufe dem der Menschenaffen (inklusive des Menschen), unterscheidet sich jedoch von Halb- und Altweltaffen. Dies könnte auf eine bestimmte Klongröße und Synchronie der spermatogonialen Stammzellen zurückzuführen sein. Jedoch unterscheidet sich das reproduktive Endokrinum bei Neuweltaffen erheblich von dem anderer Primaten, da das Luteinisierende Hormon (LH) fehlt und auch sein Rezeptor mutiert ist, hier stehen die Altweltaffen dem Menschen näher, die über ein identisches LH/CG – LH-Rezeptor System verfügen. Damit sind Neuweltaffen modellhaft für Forschungen zu zellulären Komposition und zur Entwicklung des Hodens, Altweltaffen jedoch zur Untersuchung der hormonellen Regulation anzusehen. 

 

 

 

 

Left: Comparative Analysis of primate spermatogenic efficiency proved all monkey species analyzed to exhibit similar rates of sperm production. This indicates sperm competition in monkeys to be reflected only in relative size of testes. Right: New World monkeys have a mutated LHR and developed a reproductive endocrinology dependent on CG, as LH was lost during evolution.

Experimentelle Ansätze zur translationalen andrologischen Forschung

Ein Kernthema der Erforschung männlicher Reproduktion ist die männliche Fertilität/Infertilität. Die Forschung hat dabei in den vergangenen Jahrzehnten insbesondere die Untersuchung von Pathophysiologien, die Infertilität bewirken, sowie Optionen zur Bereitstellung einer zuverlässigen männlichen Kontrazeptionsmethode in den Fokus gestellt. Zum Verständnis der Physiologie beider Aspekte sind translationale Ansätze notwendig. Wir haben durch die Analyse von Knock-Out-Mausmodellen verschiedene Gendefekte untersucht, wie etwa die CREM und die Pax8-Defizienz und verfolgen genetische Ursachen der Infertilität aktuell an einem Mausmodell für das Klinefelter Syndrom. Ein weiteres wichtiges Thema der Andrologie, die Bereitstellung einer zuverlässigen männlichen Kontrazeption auf hormoneller Basis, wurde von uns ebenfalls untersucht und die eingesetzten Substanzen (Testosteronester und Gestagene, GnRH Agonisten und Antagonisten) in ihrer Wirkung bei den für diese Studien notwendigen „nicht-humanen Primaten“, Marmosetten und Makaken (Nagerstudien sind nicht oder nur eingeschränkt übertragbar), charakterisiert um die Versuchstiere hinsichtlich ihrer grundsätzlichen Eignung für solche Studien zu definieren. Hierbei war ein ganz wesentlicher Befund, dass Neuweltaffen aufgrund ihrer spezifischen endokrinen Regulation für Studien zur hormonellen Kontrazeption ungeeignet erscheinen und nicht weiter verwendet werden sollten.
Der Erhalt der männlichen Keimbahn durch Transplantation von Keimzellen oder Hodengewebsfragmenten ist ebenfalls ein Schwerpunkt unserer Forschung. Neben der Möglichkeit die Hodenfunktionen besser zu verstehen, bieten die Methoden der Keimbahntransplantation auch Anwendungsbezüge: Ursprünglich als Methode zur Herstellung von Transgenese, später auch zum Fertilitätserhalt in malignen Patienten im Kindesalter entwickelt, wird sie inzwischen auch als Option zur Erhaltung der Keimbahnen bedrohter (Säuger)arten diskutiert. Wir haben in diesem Zusammenhang einige xenologe und autologe Transplantationsstudien unternommen, in denen wir zeigen konnten, dass die Übertragung von an Nagern gewonnen Ergebnissen auf den Menschen nicht ohne weiteres möglich ist.

In vitro Differenzierung der männlichen Keimbahn – Gametenreifung in der Petrischale

Spermatogenese ist ein äußerst komplexer Vorgang. Seit über einem Jahrhundert wird versucht, diese Ausreifung von Samenzellen in Zell- und Organkulturen nachzuvollziehen, um die Kooperation und Kommunikation zwischen den somatischen Zellen des Hodens und der Keimbahn zu verstehen und den Prozess der Haploidisierung in vitro möglichst vollständig  nachzuvollziehen. Trotz jahrzehntelanger Forschung sind diese Ansätze weitgehend experimentell geblieben. In den letzten Jahren konnten jedoch durch Verwendung neuer Kultursysteme wichtige Prinzipien entdeckt werden, die geeignet sein können, Säugetierspermien in vitro zu differenzieren. Obwohl hinsichtlich der Effizienz limitiert, konnten mit Spermien aus Gewebekulturen kürzlich erstmals auf assistiertem Weg lebende Mäuse generiert werden. In Kulturen mit Gemischen isolierter testikulärer Mauszellen konnten wir nach einigen Wochen morphologisch ausdifferenzierte Spermatozoen erhalten, nachdem zuvor nur diploide prämeiotische Zellen in Kultur genommen worden waren. Hierzu setzen wir neuartige matrixbasierte, dreidimensionale Kultursysteme ein, die auch in der regenerativen Medizin Anwendung finden (Kollagenschwämmchen, Soft Agar Culture System (SACS), Methylcellulose Culture System (MCS).

Rodent testicular cells colonize a collagen scaffold in vitro. A) 2 hours after seeding of a single cell suspension the cells are found attached to the surface of the scaffold. B)  After one day in culture wide parts of the scaffold contain testicular cells and first aggregation into small clusters is seen. C) On day 3 of culture clusters are composed of various cells types showing first signs of reassembly.

Klinefelter Syndrom als Beispiel für die Konsequenzen einer gestörten geschlechtschromosomalen Balance: das 41, XXY* Mausmodel

Das Klinefelter Syndrom (KS: sex-chromosomale Aberration, Karyotyp 47,XXY) ist mit einer Inzidenz von ca. 1:600 eine der häufigsten komplex-genetischen Erkrankungen bei Männern und steht exemplarisch für die Auswirkungen einer gestörten sexchromosomalen Balance. Diese entsteht durch eine Fehlverteilung der Geschlechtschromosomen bei der Gametenbildung der Elterngeneration. Der Karyotyp 47,XXY ist die häufigste genetische Ursache männlicher Infertilität, denn das überzählige X-Chromosom provoziert den - bis zum Erreichen der Pubertät zumeist vollständigen -Verlust der Keimzellen, ist aber eben keine letale Trisomie. Weiterhin ist generell ein veränderter endokriner Phänotyp zu beobachten, der hypergonadotrope Hypogonadismus; gekennzeichnet durch erhöhte Werte für Follikelstimulierendes und Luteinisierendes Hormon  bei erniedrigten Testosteronspiegeln. Daneben treten bei Patienten heterogen eine Vielzahl weiterer phänotypischer Änderungen auf, die teils erhebliche metabolische, kognitive und kardiovaskuläre Folgen für die Patienten haben. Die exemplarische Untersuchung des KS kann daher – neben der klinischen Relevanz für verbesserte Therapieoptionen für die betroffenen Patienten – auch zum verbesserten Verständnis genereller Mechanismen, die mit gestörten Gendosiseffekten einhergehen, beitragen. Die Untersuchung von molekularen Prozessen, die durch die gestörte chromosomale Balance ausgelöst werden, ist jedoch in klinischen Studien nur sehr eingeschränkt durchführbar. Zur Untersuchung der mit dem KS verbundenen molekularen Mechanismen ermöglicht die Verfügbarkeit einer Mauslinie mit dem Karyotyp 41,XXY*, einen experimentellen Zugang zu funktionellen Studien. So konnten wir in den vergangenen Jahren zeigen, dass die Inaktivierung des zweiten X-Chromosoms korrekt verläuft und daraus ableiten, dass nur solche Gene für die beobachteten phänotypischen Veränderungen verantwortlich sein können, die dieser Inaktivierung entkommen. Solche „escapee“ Gene sind zudem auch noch gewebespezifisch in unterschiedlichen Mustern exprimiert.  Der Keimzellverlust wird bereits viel früher manifest als bisher angenommen und scheint in der Störung der Keimbahnstammzellen zu gründen, die steroidogenen Leydigzellen hingegen sind nicht wie ursprünglich angenommen funktionell reduziert sondern im Gegenteil kompensatorisch hyperaktiviert, was die Hypothese aufgeworfen hat, dass die hypogonadalen Testosteronwerte weniger in einer sekretorischen als vielmehr in einer Störung des Hormontransportes zu suchen sind. Dieser Frage gehen wir aktuell nach und konnte bereits zeigen, dass die testikuläre Gefäßversorgung tatsächlich eingeschränkt ist, was auch mit der Verarmung und dem späteren Ausfall der spermatogonialen Stammzellen zusammenhängen könnte, da deren Einnischung gefäßabhängig erfolgt. Die von uns entwickelten Ansätze sind bereits in klinische Untersuchungen eingeflossen und haben gezeigt, dass die Untersuchung des Mausmodells relevante Rückschlüsse auf die menschliche Erkrankung zulässt und somit auch die Entwicklung neuer Therapien unterstützen kann.

Figure (adapted from Wistuba 2010)
Characterization of 41, XXY* male mice: Metaphase fluorescence in situ hybridization identification of heterosomes in a 41, XXY* male nucleus counterstained by DAPI. A) The green probe detects the X-chromosomes in the cell arrested in metaphase spread. B) The red probe detects the Y–chromosome. C) the overlay shows the Y-chromosome signals in close association to one X-chromosome. Testicular histology of adult 41, XXY* vs. 40, XY* littermate, haematoxylin staining. D) All seminiferous tubules of the XY* controls exhibited complete spermatogenesis and apparently normal distribution and number of Leydig cells (LC). E) In contrast, 41, XXY* males presented SCO tubules of decreased diameter and Leydig cell (LC) hyperplasia. The bar represents 10 μm. F) The loss of germ cells in adult 41, XXY* males is reflected in significantly reduced testis weight compared to both control. Hypergonadotropic hypogonadism results in G) reduced testosterone (XY* littermate controls vs. XXY*: not significantly different: p = 0.621, C57Bl/6 XY vs. XXY*: significantly different: p = 0.040; XXY*: n = 45, XY*: n= 45, C57Bl/6: n = 33) but H) significantly elevated FSH and I) LH serum levels in XXY* mice compared to both control groups (XXY*: n = 39, XY*: n= 38, C57Bl/6: n = 29). None of the parameters measured differed significantly between the both control groups.