1. DNA Methylierung und männliche Infertilität

Als Epigenetik (epi=dazu‚ außerdem) werden Regulationsmechanismen bezeichnet, die sich auf die Expression eines Gens auswirken, ohne dass die DNA-Sequenz an sich verändert wird. Zu den wesentlichen epigenetischen Modifikationen gehört die Histon-Modifikation, die DNA-Methylierung und die RNA Interferenz (RNAi).
Imprinting (genomische Prägung) ist ein Phänomen bei dem die Genexpression davon abhängt, von welchem Elternteil das Allel stammt. Väterlich geprägte Gene sind normalerweise in Spermien hypermethyliert (inaktiviert) während sie in der Oozyte hypomethyliert (aktiviert) sind. Ein Beispiel hierfür ist das Gen H19. In den Nachkommen wird die Expression dieser Gene deshalb durch das von der Mutter vererbte Allel gesteuert. Bei mütterlich geprägten Genen ist es genau anders herum (z.B. MEST).
In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass eine fehlerhafte DNA-Methylierung bestimmter Gene (darunter auch genomisch geprägte Gene) in Spermien zu Auffälligkeiten im Spermiogramm oder zu einer niedrigeren Fertilisationsraten führen kann (Abb.1). Darüber hinaus wird vermutet, dass sich die Wahrscheinlichkeit epigenetischer Störungen in den Nachkommen durch künstliche Befruchtung erhöht, indem natürliche Kontrollmechanismen umgangen werden. Wir versuchen die Ursachen der epigenetischen Störungen zu verstehen und ihre Auswirkungen auf die männliche Unfruchtbarkeit zu untersuchen. 

Abb.1 Mögliche Auswirkungen fehlerhafter DNA Methylierung in Spermien auf die männliche Fruchtbarkeit und die Embryoentwicklung. Eine fehlerhafte genomische Prägung in Spermien äußert sich durch Auffälligkeiten im Spermiogramm und kann unter anderem zu Problemen bei der Fertilisation, epigenetischen Krankheiten und einer erhöhten Fehlgeburtenrate führen.

2. Alterungsprozesse in männlichen Keimzellen

In westlichen Industrienationen zeichnet sich seit Jahren die Tendenz ab, dass Paare sich erst in späteren Lebensabschnitten dazu entscheiden, ein Kind zu bekommen. Die Auswirkungen des höheren mütterlichen Alters sind bereits zahlreich belegt: Neben dem gesteigerten Risiko für Infertilität aufgrund der begrenzten Anzahl von Eizellen („biologische Uhr“) steigt die Wahrscheinlichkeit für Chromosomenanomalien (z.B. Trisomie 21 beim Down Syndrom). Bei Männern hingegen findet eine lebenslange Spermatogenese statt. Mit jeder Zellteilung – und somit auch mit zunehmendem Alter des Mannes – steigt aber auch die Wahrscheinlichkeit für spontanauftretende Punktmutationen durch Fehler während der DNA-Replikation. Aufgrund dieser Anhäufung von DNA-Schäden kommt es so zu einer höheren Inzidenz von Erbkrankheiten bei Kindern von älteren Vätern.
Weitere molekulare Veränderungen in der männlichen Keimzelle umfassen die Zunahme der DNA-Fragmentierung und graduelle Längenänderung der Telomere, nicht kodierende DNA-Regionen, die zur Genomstabilität beitragen.
Abgesehen von der „klassischen“ Genetik, sind weitere epigenetische Faktoren bekannt, wie z.B. die DNA-Methylierung, die die Keimzellqualität bestimmen. Es wird angenommen, dass aberrante DNA-Methylierungsmuster mit Erkrankungen wie Autismus und Schizophrenie assoziiert sind und vermehrt in Spermien von infertilen Patienten auftreten.
Ziel unserer aktuellen Studie ist die Analyse der männlichen Keimzellen (Spermien) in einer Kohorte von 200 gesunden, klinisch umfangreich charakterisierten Probanden zwischen 20 und 83 Jahren hinsichtlich genetischer und epigenetischer altersbedingter Veränderungen. Für spätere Studien an Infertilitätspatienten können diese Basisdaten von gesunden Männern dann als Referenzwerte herangezogen werden.

Abb.1

Abb.1  Einfluss des Alters auf die männliche Fertilität und Risiken für die Nachkommen (Gromoll et al. 2016).

3. Funktionelle Analyse und klinische Bedeutung von genetischen Polymorphismen im FSHB und FSHR Gen

Das Hypophysenhormon FSH ist essentiell für die Initiation und Aufrechterhaltung der Spermatogenese beim Menschen. Kürzlich konnten wir zeigen, dass Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) im FSHB Gen und im  FSHR Gen die FSH- Wirkung signifikant beeinflussen können und somit auch die Spermatogenese. Wir haben ein Model entwickelt (Abb.3), welches die Auswirkung von vorteilhaften und unvorteilhaften SNP-Kombinationen auf das Hodenvolumen und die Spermienanzahl aufzeigt. Aktuell führen wir experimentelle und klinische Studien durch, um herauszufinden, welche molekularen Mechanismen durch die SNPs beeinflusst sind.  

Die bisher identifizierten SNPs sind von hoher Relevanz für neue Therapieoptionen für infertile Männer. Allerding erklären die bisher identifizierten SNPs im FSHB und FSHR Gen nur einen gewissen Prozentsatz der beobachteten FSH-Serum Variationen, sodass eine erweiterte genetische Analyse nötig ist. Wir gehen davon aus, dass die Entschlüsselung des FSH- Signalnetzwerks und die damit interagierenden genetischen Varianten, zu einer verbesserten Diagnostik von infertilen Patienten führt. Bei diesen Patienten könnte eine FSH-Behandlung zu einer Stimulation  der Spermatogenese führen und somit wäre assistierte Reproduktion zur Erfüllung des Kinderwunsches nicht nötig. In unserem Forschungsansatz werden wir Genome Wide Association Studies (GWAS) anwenden, um neue genetische Varianten, die das FSH Netzwerk beeinflussen, zu identifizieren. Dies wird in einer definierten Patientengruppe mit anschließender Validierungsstudie stattfinden. Des Weiteren werden wir die FSH Ausschüttung und FSHR Signalwege untersuchen und schlussendlich funktionelle Studien mit den identifizierten genetischen Varianten durchführen.

Die Zusammenarbeit von klinischer, genetischer und experimenteller Forschung wird zur Identifizierung funktionaler SNPs führen, welche die FSH Wirkung in der Spermatogenese in (infertilen) Männern beeinflussen (Entwicklung eines FSH SNP-Panel). 

Das FSH Netzwerk reguliert die komplexe Interaktion zwischen Keimzellen und Sertoli Zellen. Unsere Studie verschafft wichtige Einblicke in die Einflüsse von FSH auf die Spermatogenese und identifiziert neue endokrine und genetische Faktoren. Hierdurch könnten neue Behandlungsstrategien für infertile Männer entstehen und diese somit zu verbesserten Schwangerschaftsraten und verminderten Risiken für die Nachkommen beitragen als auch die psychologische und sozioökonomische Belastung von künstlicher Befruchtung herabsetzen.

Abb.3

Abb.3 Model für den Effekt von FSHB -211G>T und FSHR 2039A>G. A, eine abnehmende transkriptionelle Aktivität (FSHB -211G>T, stärkerer Effekt) und Rezeptorsensitivität (FSHR 2039A>G, schwächerer Effekt) führen beide jeweils zu einer Reduktion des Hodenvolumens, welcher durch den Kreisdurchmesser dargestellt ist. Die Farben zeigen Genotypen mit vermutlich besseren (grün) und schlechteren (rot) Auswirkungen auf die Fortpflanzungsfähigkeit. Die Nummern innerhalb der Kreise geben die Anzahl an Trägern der jeweiligen Genotyp-Kombinationen innerhalb der Studienpopulation wieder. Anhand des Modells wird das niedrigste Hodenvolumen für Träger der TT/GG Allelkombination vorhergesagt. Männer mit den unvorteilhaftesten Genotyp Kombinationen sind durch schwarze Linien miteinander verbunden.

Abb.2

Abb.2 FSH und FSHR Proteinstruktur. Der Komplex besteht aus FSH (oben) und FSHR (unten). FSH beinhaltet Untereinheiten α und β und FSHR besteht aus einer extrazelluläre, membran und intracellulären Proteindomänen. (3-D Model erzeugt von Gunnar Kleinau, Charité Berlin, Deutschland)

5. Geno- und Phänotypcharakterisierung von Männern mit 46,XX testicular DSD

46,XX TDSD ist eine seltene Störung der Geschlechtsentwicklung, die sich durch einen weiblichen Genotyp mit gleichzeitig männlichen Phänotyp auszeichnet. In den meisten Fällen ist das SRY Gen, das für die Hodenbildung essentiell ist,  auf ein anderes Chromosom verlagert und ermöglicht somit die Entwicklung der Hoden. Es gibt jedoch auch seltenere Fälle ohne diese SRY Translokation. Hier sind andere Gene, die eine wichtige Rolle in der Geschlechtsentwicklung spielen, mutiert. Da andere Abschnitte des Y Chromosoms, wie zum Beispiel die AZF Region, fehlen, leiden alle Patienten mit eine 46,XX TDSD unter einer Azoospermie.Obwohl einige Untersuchungen zu diesem Krankheitsbild  und Studien in der Vergangenheit durchgeführt worden sind,  sind viele genetische, epigenetische und klinische Hintergründe des 46, XX TDSD bis heute unklar. Da unser Centrum Zugriff auf eine der größte Kohorte an 46, XX TDSD Patienten hat, wollen wir die Auswirkungen der genetischen Besonderheiten auf den physischen, epigenetischen und neurokognitiven Status der Patienten untersuchen. Einige dieser Projekte werden in Zusammenarbeit mit dem Institut für Humangenetik und der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie durchgeführt. Ziel unserer Arbeiten ist es, diesen Patienten in Zukunft eine adäquate Behandlung, basierend auf unseren Ergebnissen, zu ermöglichen.

Abb.1

Abb.1 Prozesse der Geschlechtsentwicklung. Der erste Schritt der Geschlechtsentwicklung ist genetisch kontrolliert. Danach folgt eine hormonelle Steuerung welche bis zum Endzustand reicht und beibehalten wird. 

Abb.2

Abb.2 Y-Chromosom mit SRY Gen auf dem kurzen Arm und AZF Region auf dem langen Arm. SRY spielt eine große Rolle in der Hodenentwicklung, die AZF Region beinhaltet verschiedene essenzielle gene zur Regulation der Spermatogenese.

 

6. Die Rolle der humanen RHOX Gene bei der Spermatogenese

Homeobox-Gene codieren für Transkriptionsfaktoren und zeichnen sich durch ein 60 Aminosäure langes Helix-turn-Helix-Motiv aus, welches man Homeodomäne nennt. Eine kürzlich entdeckte Unterfamilie dieser Gene liegt geclustert auf dem X Chromosom vor und wird selektiv in den männlichen und weiblichen Fortpflanzungsorganen exprimiert. Diese sogenannten reproduktiven homeobox (RHOX) Gene wurden bisher hauptsächlich in der Maus und in der Ratte untersucht, aber es ist nur wenig über sie im Menschen bekannt. Sicher ist, dass das humane RHOX Cluster aus drei Genen besteht: RHOXF1 und zwei nahezu identischen Kopien von RHOXF2 (RHOXF2 und RHOXF2B; Abb.2). Die RHOXF2 Genkopien liegen sich in umgekehrter Orientierung gegenüber und weisen eine Sequenzähnlichkeit von 99,8 % auf.

Abb.2 Struktur der menschlichen RHOX Gene auf dem X Chromosom. A) Zwei Kopien von RHOXF2 (RHOXF2 und RHOXF2B) liegen in umgekehrter Orientierung auf dem X-Chromosom und flankieren das RHOXF1 Gen. B) RHOXF1 besteht aus 3 Exons (grün), RHOXF2 (gelb) und RHOXF2B (rot) aus jeweils 4 Exons. Die für Homebox Gene charakteristische Homeodomäne ist in schwarz dargestellt (verändert nach Richardson et al. 2014)


Eine kürzlich veröffentlichte Studie hat gezeigt, dass RHOX Gene die höchsten Expressionslevel im Hoden zeigen und die Proteine fast ausschließlich von den dort ansässigen Keimzellen exprimiert werden (Song et al. 2013). Darüber hinaus konnte ein Zusammenhang zwischen männlicher Unfruchtbarkeit und veränderter DNA-Methylierung (Hypermethylierung) in der Promotorregion der RHOX-Gene nachgewiesen werden (Richardson et al. 2014). Zurzeit untersuchen wir die molekulare und biologische Funktion der RHOX-Gene, in dem wir

             (I)    Mutation in den RHOX-Genen und ihre potentiellen Auswirkungen auf die Spermatogenese analysieren
             (II)    Zielgene und damit nachfolgende Signalwege von RHOX identifizieren
             (III)    Die Ursache der gestörten epigenetischen Regulation von RHOX ermitteln